【產(chǎn)品名稱】

通用名稱：禽流感病毒H3亞型RT-PCR檢測(cè)試劑盒

英文名稱：Avian Influenza virus H3 hemagglutinin subtypes RT-PCR Detection Kit

【包裝規(guī)格】10頭份/盒 & 50頭份/盒

【預(yù)期用途】

本試劑盒適用于禽流感病毒檢測(cè)，定性檢測(cè)禽流感病毒H3亞型，對(duì)禽流感病毒引起的流感及其并發(fā)癥的診斷及療效評(píng)估有重要指導(dǎo)意義。

【檢驗(yàn)原理】

利用離心柱內(nèi)硅基質(zhì)膜提取RNA，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，以RNA為模板，以引物為起點(diǎn)合成與RNA模板互補(bǔ)的cDNA鏈。在TaqDNA聚合酶的作用下，經(jīng)高溫變性、低溫退火、中溫延伸的循環(huán)，使特異DNA片段的拷貝數(shù)放大一倍。經(jīng)過35次循環(huán)，最終使擴(kuò)增DNA片段放大了數(shù)百萬倍。將擴(kuò)增DNA片段進(jìn)行電泳，經(jīng)染色后，在紫外燈照射下，肉眼可見到DNA片段的擴(kuò)增帶。

【主要組成成份】

注：陰性對(duì)照為禽類基因組DNA，陽性對(duì)照為失去活性的禽流感病毒H3亞型cDNA。

【儲(chǔ)存條件及有效期】-20℃以下保存，避免反復(fù)凍融，有效期12個(gè)月。

【需自備的物品】

1.儀器：分析天平、離心機(jī)、PCR擴(kuò)增儀、電泳儀、電泳槽、紫外凝膠成像儀（或紫外分析儀）、微波爐、-20 ℃冰箱、可調(diào)移液器（2 μL、20 μL、200 μL、1000 μL）。

2.耗材：眼科剪、眼科鑷、稱量紙、20 mL一次性注射器、生理鹽水、瓊脂糖、500 mL量筒、500 mL錐形瓶、經(jīng)焦碳酸二乙酯（DEPC）水處理的滅菌1.5mL離心管和吸頭（10 μL、200 μL、1000 μL）、滅菌雙蒸水。

【注意事項(xiàng)】

1.病毒具有很強(qiáng)的感染能力，操作前必須準(zhǔn)備好各種防御措施。

2.操作時(shí)須嚴(yán)格按照步驟進(jìn)行，廢物必須放入含消毒液的廢物缸，以免污染實(shí)驗(yàn)室和工作人員。

3.為避免其他核酸的污染而出現(xiàn)假陽性，必須使用不含DNA和RNA的離心管、吸管、槍頭、試劑和手套，操作人員須戴口罩。

4.Buffer V-L、Buffer V-N和Buffer W1A含刺激性化合物，操作時(shí)要戴乳膠手套和眼鏡，避免沾染皮膚、眼睛和衣服，謹(jǐn)防吸入口鼻。

【實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備】

第一次使用時(shí)，請(qǐng)?jiān)?/span>Buffer W1 A和Buffer W2 concentrate中按試劑瓶上指定的體積加入無水乙醇；

準(zhǔn)備異丙醇（1%冰乙酸）：即99ml異丙醇中加入1ml冰乙酸，混合均勻，室溫密閉儲(chǔ)存；

如果是提取病毒RNA，請(qǐng)選用RNase free Tip槍頭和1.5 ml離心管或?qū)岊^和離心管用0.1% DEPC水處理后再使用。

【操作步驟】

樣本采集：采用鼻拭子、咽拭子等方法獲得樣本。具體操作方法如下：

（1）鼻拭子： 操作者將沾濕的無菌拭子平行于上腭的角度輕輕地左右轉(zhuǎn)動(dòng)從一側(cè)鼻孔插入至鼻道內(nèi)鼻腭處，一般當(dāng)拭子插入有阻力時(shí)再將拭子停留2～3s后緩慢轉(zhuǎn)動(dòng)退出。

（2）咽拭子：操作者一手持壓舌板壓住病人舌后根，另一手拿住無菌拭子根部，然后將沾濕的無菌拭子左右兩面及拭子頭部快速且較用力地分別刮取扁桃腺兩側(cè)及咽后壁的分泌物。

（3）將鼻拭子和咽拭子一起放人盛有1.0ml生理鹽水的離心管中備用。

2. 樣品處理：每份樣品分別處理。

（1）無細(xì)胞體液樣品處理：收集200 μL樣品，轉(zhuǎn)入到1.5 ml離心管中；

（2）全血樣品處理：待血凝后取血清 200 μL , 轉(zhuǎn)入到1.5 ml離心管中；

（3）組織樣品處理：每份組織分別從三個(gè)不同的位置稱取樣品約 1g ，用手術(shù)剪碎混勻后取 ，用手術(shù)剪碎混勻后取 0.05 g于研磨器中，加入1.5 mL生理鹽水繼續(xù)充分研磨，待勻漿后轉(zhuǎn)至1.5 mL 滅菌離心管中，12,000 rpm離心 5 min，取上清液 200 μL 于1.5 mL離心管中。

3. 提取過程：

（1）向上一步轉(zhuǎn)入樣品的1.5 mL的離心管中，加入200 μL Buffer V-L，渦旋振蕩混合均勻，靜置5 min。

（2）加入75 μL Buffer V-N，渦旋振蕩混合均勻后，于12,000 rpm離心5 min。

（3）將上清液轉(zhuǎn)移到新的2mL離心管（試劑盒內(nèi)已提供）中，加300 μL異丙醇（1%冰乙酸），上下倒置6-8次，混合均勻。

（4）將制備管置于2ml離心管（試劑盒內(nèi)提供）中，取上一步驟中的混合液移入制備管中，6,000 rpm離心1 min。

（5）棄濾液，將制備管放回到2 ml離心管中，加入500 μL Buffer W1A（確認(rèn)已按要求加入無水乙醇），室溫靜置1min，于12,000rpm離心1 min。

（6）棄濾液，將制備管放回到2 ml離心管中，加入800 μL Buffer W2（確認(rèn)已按要求加入無水乙醇），于12,000 rpm離心1 min。

（7）將制備管放回到2 ml離心管中，12,000 rpm離心1 min。

（8）將制備管置于潔凈的1.5 ml離心管（試劑盒內(nèi)已提供）中，在制備管膜中央加入40-60 μL Buffer TE（nuclease-free），室溫靜置1min，于12,000rpm離心1-2min洗脫DNA/RNA。

注：洗脫體積越大，洗脫效率越高。如果需要DNA/RNA濃度較高，可以將洗脫的DNA/RNA再次過柱離心洗脫一次；或適當(dāng)減少洗脫體積， 但是最小體積不應(yīng)少于30 μl，體積過小降低洗脫效率，減少RNA產(chǎn)量。

4. RT-PCR擴(kuò)增

每份總體積20 μL，含15 μL RT-PCR反應(yīng)液（用前混勻），3μL 混合酶液，2 μL模板RNA。

例如：n份樣品，配制n+1份，15×（n+1）RT-PCR反應(yīng)液， 3×（n+1）混合酶液勻后取18 μL分裝成n份，分別加入2 μL模板RNA，作好標(biāo)記。

在PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行以下程序：50 ℃ 10 min，94 ℃ 3 min；循環(huán)94℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35次；再72 ℃延伸7 min。

5. 電泳

稱1.5 g瓊脂糖放于500 mL錐形瓶中，加入50倍稀釋的TAE電泳緩沖液100 mL（取2 mL 50倍TAE電泳緩沖液，用雙蒸水稀釋至100 mL），于微波爐中熔解，再加入50 μL染色液混勻。在電泳槽內(nèi)放好梳子，倒入瓊脂糖凝膠，待凝固后將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10 μL點(diǎn)樣于瓊脂糖凝膠孔中，以110～120V電壓于50倍稀釋的TAE電泳緩沖液中電泳，紫外燈下觀察結(jié)果。

【結(jié)果判定】

陽性對(duì)照出現(xiàn)230 bp擴(kuò)增帶、陰性對(duì)照無帶出現(xiàn)（引物帶除外）時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果成立。被檢樣品出現(xiàn)230 bp擴(kuò)增帶為禽流感病毒H3亞型陽性，否則為陰性。