非洲豬瘟病毒微流控?zé)晒?/span>PCR快速檢測(cè)試劑盒

LabChip Ultra Fast Fluorescence PCR Detection Kit for African Swine Fever Virus

【預(yù)期用途】

非洲豬瘟（African swine fever, ASF）是由非洲豬瘟病毒（ASFV）引起豬的一種急性、熱性、高度接觸性動(dòng)物傳染病，臨床上以高熱、網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)出血和高死亡率為特征，易感豬群的病死率高達(dá)100%。我國(guó)將其列為一類(lèi)動(dòng)物疫病，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為法定報(bào)告動(dòng)物疫病，并且列入《禁止生物武器公約》核查動(dòng)物病原體清單。

本試劑盒用于對(duì)樣品中的非洲豬瘟 DNA 進(jìn)行快速定性檢測(cè)，可用于該病毒感染的實(shí)驗(yàn)室診斷和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果僅供臨床參考，不能單獨(dú)作為確診或排除病例的依據(jù)。實(shí)驗(yàn)操作人員應(yīng)接受過(guò)基因擴(kuò)增或分子生物學(xué)方法檢測(cè)的專(zhuān)業(yè)培訓(xùn)，具備相關(guān)的實(shí)驗(yàn)操作資格。

【檢測(cè)原理】

本試劑盒利用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)，以非洲豬瘟病毒基因組的高度保守區(qū)為靶區(qū)域，設(shè)計(jì)特異性引物及探針，探針標(biāo)記FAM熒光素，配以Taq DNA 聚合酶等成分，使用配套的極速熒光PCR設(shè)備進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，從而對(duì)樣品中非洲豬瘟病毒DNA 進(jìn)行快速定性檢測(cè)。

【主要組成成份】

注：不同批號(hào)試劑盒的成份不可以互換使用。

【包裝規(guī)格】

40頭份/盒

【儲(chǔ)存條件及有效期】

試劑于-20℃儲(chǔ)存；反復(fù)凍融不超過(guò) 5 次；有效期12個(gè)月。

【適用儀器】

ZR-LC16/ V280 / UF-150型微流控極速熒光定量PCR儀。

【樣品要求】

1.適用標(biāo)本類(lèi)型：血液、組織、血粉、飼料等。

2.標(biāo)本采集與處理

（1）血液樣品：用EDTA抗凝采血管采集血液，充分混勻，編號(hào)備用。

（2）組織樣品：用無(wú)菌剪刀和鑷子剪取病死或剖殺豬主要臟器（淋巴結(jié)、脾臟、扁桃體）約2g，加入10倍體積PBS或生理鹽水，于研缽或組織勻漿器中充分研磨后轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管中編號(hào)備用。

（3）血粉：同上處理，只不過(guò)省掉研磨步驟。

（4）飼料等其它樣品：參照專(zhuān)用的商品化提取試劑盒的說(shuō)明書(shū)操作。

3.樣本的儲(chǔ)存

樣品可立即用于檢測(cè)，如不能立即檢測(cè)，在 4℃保存不超過(guò) 24 小時(shí)，-20℃保存不超過(guò)3個(gè)月，-70℃可長(zhǎng)期保存，反復(fù)凍融不超過(guò) 5 次。

【檢測(cè)方法】

一、病毒DNA的提取

（1）待檢樣品份數(shù)總和用n表示 ，取n個(gè)滅菌的離心管，逐管編號(hào)。

（2）每管加入處理液A 30μl。

（3）每管分別加入已處理的待檢樣品3μl，充分混勻，18-25℃處理5分鐘，旋渦震蕩30秒。

（4）每管加入處理液B 30μl，震蕩混勻，待檢。

（5）處理后的樣本如在2小時(shí)內(nèi)進(jìn)行下一步試驗(yàn)，請(qǐng)于4℃保存，如不能立即進(jìn)行下一步試驗(yàn)，請(qǐng)于-20℃保存。

備注：飼料等其它樣品，此步驟同樣參照專(zhuān)用的商品化提取試劑盒的說(shuō)明書(shū)操作。

二、PCR試劑配置（在試劑準(zhǔn)備區(qū)進(jìn)行）及加樣（在樣品處理區(qū)進(jìn)行）。

1. 在試劑準(zhǔn)備區(qū)，按下列組成配制PCR 混合液（n為待測(cè)樣本數(shù)+1陽(yáng)性對(duì)照+1陰性對(duì)照）：

（注意：使用前確保PCR反應(yīng)液和DNA聚合酶充分融化）

2. 將PCR混合液按7μl/管 分裝至PCR反應(yīng)管中，并移至樣品處理區(qū)。

3. 用帶濾芯的吸嘴分別取已處理好的樣品、陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照各3μl分別加到裝有 PCR混合液的反應(yīng)管中漩渦混勻、瞬時(shí)離心。

4. 使用UF-150型號(hào)的儀器，各取 10μl 加入PCR 擴(kuò)增芯片中，蓋上芯片膜，移至擴(kuò)增檢測(cè)區(qū)。

使用V280、ZR-LC16型號(hào)的儀器，各取 8μl 加入PCR 擴(kuò)增芯片中，蓋上芯片蓋，移至擴(kuò)增檢測(cè)區(qū)。

三、PCR擴(kuò)增檢測(cè)（在擴(kuò)增檢測(cè)區(qū)進(jìn)行）

1. 將PCR 芯片插入微流控極速熒光定量PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)。

2. 循環(huán)參數(shù)設(shè)定：

3. 儀器檢測(cè)通道選擇：熒光信號(hào)選擇FAM 通道。

四、質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)

1. 陰性對(duì)照：結(jié)果為陰性。

2. 陽(yáng)性對(duì)照：結(jié)果為陽(yáng)性，陽(yáng)性對(duì)照 Ct 值≤33。

3. 以上兩項(xiàng)需在一次實(shí)驗(yàn)中同時(shí)滿足，否則，本次實(shí)驗(yàn)無(wú)效，實(shí)驗(yàn)應(yīng)重新進(jìn)行。

五、結(jié)果分析

1. 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，根據(jù)相關(guān)儀器的軟件進(jìn)行分析，調(diào)節(jié)噪聲容限至基線噪聲以上，使陰性對(duì)照 Ct 值不出現(xiàn)任何數(shù)值。

2. 閾值設(shè)定原則以閾值線剛好超過(guò)正常陰性對(duì)照曲線（無(wú)規(guī)則的噪音線）的最高點(diǎn)為準(zhǔn)。

3. 記錄儀器自動(dòng)分析計(jì)算出的樣品 Ct 值。

【臨界值】本試劑盒的臨界值為Ct值= 38。

【檢測(cè)結(jié)果的解釋】

1. 每次實(shí)驗(yàn)均需將試劑盒內(nèi)的陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照與待檢樣品一同檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果應(yīng)符合其性能指標(biāo)，否則本次實(shí)驗(yàn)無(wú)效。

2. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果判斷方法

2.1陰性結(jié)果判定：如果樣品在 FAM 通道擴(kuò)增曲線均不呈 S 型、Ct 值為 UNDET 或者＞38.00。

2.2.陽(yáng)性結(jié)果判定：如果樣品在 FAM 通道擴(kuò)增曲線呈S 型且Ct 值≤38，則結(jié)果為陽(yáng)性。

3. 在質(zhì)控正常的前提下，實(shí)驗(yàn)結(jié)果判讀模式

3.1陽(yáng)性樣品報(bào)告格式為：樣品檢測(cè)到非洲豬瘟病毒DNA，濃度高于試劑盒的檢測(cè)限；

3.2陰性樣品報(bào)告格式為：樣品未檢測(cè)到非洲豬瘟病毒DNA，濃度低于試劑盒的檢測(cè)限。