【產(chǎn)品名稱】

通用名稱：貓杯狀病毒檢測試劑盒（實時熒光PCR法）

英文名稱：Feline Calic Virus Detection Kit (Real-Time PCR Method)

【包裝規(guī)格】 25T/盒 & 50T/盒

【預(yù)期用途】

本試劑盒適用于貓杯狀病毒檢測，不進行病毒分型，可用于臨床貓杯狀病毒感染的輔助診斷，但不作確診使用。

【檢驗原理】

本試劑盒針對貓杯狀病毒基因組高度保守區(qū)域設(shè)計特異性引物和探針，在反應(yīng)體系中含貓杯狀病毒基因組模板的情況下，PCR反應(yīng)得以進行并釋放熒光信號。利用熒光定量PCR儀對PCR過程中相應(yīng)通道信號進行實時監(jiān)測和輸出，實現(xiàn)檢測結(jié)果的定性分析。

【主要組成成份】

注：陰性對照為貓基因組DNA，陽性對照為失去活性的貓杯狀病毒cDNA。

【儲存條件及有效期】避光-20℃以下保存，避免反復(fù)凍融，有效期12個月。

【適用儀器】ABI 系列、Bio-Rad系列、Agilent Stratagene MX系列 、Roche LightCycler R480、Cepheid SmartCycler、Rotor-Gene系列、杭州博日系列等多通道實時熒光定量PCR儀。

【樣本要求】

1.樣品取鼻拭子、口腔潰瘍面拭子、結(jié)膜拭子，采集方法如下：

(1) 鼻拭子：將棉簽輕輕插入鼻道內(nèi)鼻腭處，停留片刻后緩慢轉(zhuǎn)動退出。以同一拭子拭兩側(cè)鼻孔。將棉簽浸入2-4 ml采樣液中，尾部棄去。

(2) 口腔潰瘍面拭子：用棉簽擦拭舌、硬腭、腭中裂周圍，同樣將棉簽頭浸入2-4 ml采樣液中，尾部棄去。

(3) 結(jié)膜拭子：用棉簽擦拭眼周圍分泌物，同樣將棉簽頭浸入2-4 ml采樣液中，尾部棄去。

2.血液或血清樣品：使用無菌注射液抽取樣品置于離心管中待檢。

3.肺臟、脾臟、淋巴結(jié)等組織樣品：取少量樣品（2~3克）于研缽或勻漿器中研磨，然后將研磨勻漿轉(zhuǎn)入無菌離心管中，3000rpm/min離心10分鐘取上清待檢。

4.應(yīng)避免標(biāo)本間交叉污染。

【檢驗方法】

1. 試劑準(zhǔn)備（試劑準(zhǔn)備區(qū)）

a.計算當(dāng)次實驗所需要的反應(yīng)數(shù)，從-20℃以下冰箱保存的試劑盒中取等量8聯(lián)PCR反應(yīng)管（內(nèi)裝有PCR反應(yīng)液）,平衡至室溫；預(yù)留一管作為陰性對照一管作為陽性對照。

b.將實驗所需的8聯(lián)PCR反應(yīng)管轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū)。

2.樣本準(zhǔn)備（樣本處理區(qū)）

用QIAGEN、Roche公司RNA提取試劑盒提取RNA，具體操作按照其試劑盒說明書操作。

3.加樣

a.取出8聯(lián)PCR反應(yīng)管試劑，瞬時離心以去除管壁附著液體。

b.打開反應(yīng)管管蓋，在液封層上（切勿插入底部）加入5 μL處理好的樣本重懸液；陰性對照和陽性對照管則各加5 μL陰性對照或陽性對照品；

c.蓋好PCR反應(yīng)管蓋，瞬時離心以去除管壁附著液體。

d.記錄模板加樣順序。將PCR反應(yīng)管轉(zhuǎn)移到PCR擴增區(qū)進行PCR檢測。

4.PCR（PCR擴增區(qū)）

（1）取樣本處理區(qū)準(zhǔn)備好的PCR反應(yīng)管，放置在實時熒光定量PCR儀樣品槽相應(yīng)位置，并記錄放置順序。

（2）按下表設(shè)置儀器核酸擴增相關(guān)參數(shù)進行PCR擴增。

注：ABI系列熒光PCR儀在設(shè)置時不選ROX校正，設(shè)置淬滅基團選擇None。

【參考值（參考范圍）】

1.試劑盒有效性判定：

（1）陽性對照：有典型S型擴增曲線或Ct值≤35。

（2）陰性對照：Ct值＞38或無Ct值，線形為直線或輕微斜線，無指數(shù)增長期。

2.標(biāo)本結(jié)果判定：

（1）陽性：標(biāo)本檢測結(jié)果Ct值≤35或有明顯指數(shù)增長期。

（2）可疑：標(biāo)本檢測結(jié)果Ct值在35～38范圍內(nèi)。此時應(yīng)對標(biāo)本進行重復(fù)檢測，如重復(fù)實驗結(jié)果Ct值仍在35～38范圍內(nèi)，有明顯指數(shù)增長期，則判定為陽性，否則為陰性。

（3）陰性：標(biāo)本檢測結(jié)果Ct值＞38或無Ct值。

【檢驗結(jié)果的解釋】

【檢驗方法的局限性】

1. 當(dāng)檢測樣本中被檢核酸濃度低于本試劑盒的最低檢出限時可能會發(fā)生假陰性的結(jié)果。

2. 被檢樣本在采集、運輸、儲存以及處理過程中操作方式不當(dāng)容易造成RNA降解而產(chǎn)生假陰性結(jié)果。

3. 樣本在采集、運輸、儲存以及處理過程中發(fā)生交叉污染，則容易得到假陽性結(jié)果。

【產(chǎn)品性能指標(biāo)】 產(chǎn)品的最低檢出限為102 Copies/mL，產(chǎn)品CV值≤5%。

【注意事項】

1. 整個檢測過程應(yīng)嚴(yán)格按照本說明書要求分別在試劑準(zhǔn)備區(qū)、樣本處理區(qū)和PCR擴增區(qū)進行操作，各區(qū)實驗服、儀器、耗材應(yīng)獨立使用，不能混用；實驗用吸頭采用帶濾芯吸頭；樣本處理區(qū)應(yīng)配有生物安全柜，樣本處理在生物安全柜中進行操作；三個區(qū)應(yīng)該配有紫外線殺菌裝置。

2. 為避免RNA降解，樣本處理過程應(yīng)在0-4℃條件下操作，且完成實驗后立即上機檢測；樣本處理過程中使用的器具耗材應(yīng)經(jīng)過無核酶處理。

3. 每次實驗應(yīng)該設(shè)置陰、陽性對照。

4. 試劑盒所有試劑在使用前應(yīng)該在常溫下充分融化混勻，并應(yīng)瞬時離心。

5. 試劑盒內(nèi)所配陰性和陽性對照在第一次使用前應(yīng)全部轉(zhuǎn)移至標(biāo)本準(zhǔn)備區(qū)，并單獨存放。

6. 為防止熒光干擾，應(yīng)避免裸手直接接觸PCR反應(yīng)管，并應(yīng)避免在PCR反應(yīng)管上進行任何標(biāo)記。

7. 儀器擴增相關(guān)參數(shù)應(yīng)按照本說明書相關(guān)要求進行設(shè)置；不同批號試劑不能混用。

8. ABI系列熒光定量PCR儀參數(shù)設(shè)置中不選ROX校正，淬滅基因選擇None。

9. 實驗過程中產(chǎn)品的廢棄物應(yīng)該進行無害化處理后方可丟棄。