豬乙腦病毒（JEV）抗體檢測試劑盒用于檢測豬血清中的豬乙腦病毒抗體，評估養(yǎng)豬場豬乙腦病毒疫苗免疫狀況及感染豬的血清學(xué)輔助診斷。

本試劑盒采用間接ELISA法，在酶標(biāo)板條微孔上預(yù)包被純化的豬乙腦病毒。在試驗(yàn)中，加入稀釋后的待檢血清，經(jīng)過溫育后，若樣品中含有JEV特異性抗體，則與包被板上的抗原結(jié)合，經(jīng)洗滌除去未結(jié)合的抗體和其他成分后；再加入酶標(biāo)二抗，與檢測板上的抗原抗體復(fù)合物發(fā)生特異性結(jié)合；再經(jīng)洗滌除去未結(jié)合的酶結(jié)合物；在微孔中加入TMB底物液，經(jīng)酶催化形成藍(lán)色產(chǎn)物，加入終止液終止反應(yīng)后，用酶標(biāo)儀450nm波長測定反應(yīng)孔中的吸光度A值。

組份

需自備的設(shè)備及試劑

1. 微量移液器： 0.5μl-10μl、10μl-100μl、100μl-1000μl。

2. 一次性移液器吸頭。

3. 量筒：500ml。

4. 96孔板酶標(biāo)儀。

5. 蒸餾水或去離子水。

6. 洗瓶或洗板機(jī)。

 樣品制備

取動物全血，按常規(guī)方法制備血清，要求血清清亮，無溶血。

洗滌液的準(zhǔn)備

濃縮洗滌液使用前應(yīng)恢復(fù)至室溫，如有鹽結(jié)晶，搖動使結(jié)晶的鹽溶解，然后用蒸餾水或去離子水作10倍稀釋。稀釋好的洗滌液可在4℃存放一周左右。

樣品的稀釋

在血清稀釋板中按1：100的體積比稀釋待檢血清。

注意：陰性和陽性對照不用稀釋。取每個樣品后都要更換吸頭，準(zhǔn)確記錄每個樣品在板上的位置。每個樣品在加入到包被板微孔前應(yīng)充分混勻。

注意事項(xiàng)

1. 試劑盒使用前各試劑應(yīng)平衡至室溫，應(yīng)將試劑盒各組份放置室溫至少1小時以上。使用前應(yīng)搖勻，使用后放回2-8℃。

2. 不同品種、不同批號試劑盒的試劑組分不得混用，使用試劑時應(yīng)防止試劑污染。

3. 底物和終止液對皮膚和眼可能有刺激性，使用時應(yīng)該注意防護(hù)。

4. TMB（顯色液）不要暴露于強(qiáng)光和避免接觸氧化劑。

5. 檢測板拆封后應(yīng)避免受潮或沾水(未用完的抗原包被板加干燥劑放于自封袋中，并盡快置于2-8℃)。

6. 所有廢棄物在丟棄之前應(yīng)合理處理以免污染。

7. 嚴(yán)格遵守操作說明可以獲得最好的結(jié)果。操作過程中移液、定時和洗滌等的全部過程必須精確。

8. 血清稀釋板為一次性用品，不得重復(fù)使用；血清稀釋板的最大容量為300μl/孔。

操作步驟

1. 取預(yù)包被的檢測板（根據(jù)樣品多少，可拆開分次使用），將稀釋好的待檢血清取100μl加入到檢測板孔中。同時設(shè)陰性對照1孔，陽性對照2孔，取陰性及陽性對照各100μl分別加入反應(yīng)孔中輕輕振勻孔中樣品（勿溢出）。

2. 蓋上封板膜（可按實(shí)際需要自行裁剪），置37℃溫育30分鐘。

3. 小心揭開封板膜，甩掉板孔中的溶液，使用工作濃度洗滌液每孔加250ul，后甩去孔內(nèi)液體，以上步驟重復(fù)4-6次，最后在干凈吸水紙上拍干。

4. 每孔加酶結(jié)合物50μl，蓋上封板膜，置37℃溫育30分鐘。

5. 小心揭開封板膜，甩掉板孔中的溶液，洗滌4-6次, 方法同3。切記最后在干凈吸水紙上拍干。

6. 每孔加顯色液100μl，輕微震蕩混勻、蓋上封板膜37℃閉光顯色10分鐘。

7. 每孔加終止液50μl，使反應(yīng)終止，10分鐘內(nèi)測定結(jié)果。

結(jié)果判定

用酶標(biāo)儀于450nm（630nm作參比波長）讀取吸光度OD值。

試驗(yàn)成立的條件是：

陰性對照（N）OD值<0.20，同時陽性對照（P）OD值〉0.5。

計(jì)算方法：

樣品OD值÷陽性對照OD均值=S/P值

陰陽性判斷：

S/P值≥0.4判斷為陽性；

S/P值<0.4判斷為陰性。

貯存方法： 2 - 8oC下貯存。

有效期： 12個月